Lo studio del metabolismo del glucosio
Lo studio del metabolismo del glucosio: il test del rosso metile (MR) e il test Voges Proskauer (VP) in laboratorio di chimica
METABOLISMO DEL GLUCOSIO
La prova del rosso metile (MR) e la prova di Voges Proskauer (VP) sono importanti per l’identificazione degli enterobatteri..
Gli enterobatteri utilizzano il glucosio attraverso due particolari vie fermentantative, che partendo dall’acido piruvico originano prodotti finali diversi:
- la fermentazione butandiolica (o glicol-butilenica) ha come prodotti finali principali: etanolo, 2,3 butandiolo, acido formico (che in presenza di formico-idrogenoliasi viene scisso in idrogeno e anidride carbonica);
- la fermentazone acido mista ha come principali prodotti finali: etanolo, acido acetico, acido lattico, acido formico (che in presenza di formico-idrogenoliasi viene scisso in idrogeno e anidride carbonica).
Terreno utilizzato: brodo MR-VP
Composizione g/l
peptone 5 g
D(+) glucosio 5 g
di-potassio idrogeno fosfato 2,5 g
potassio di-idrogeno fosfato 2,5 g
ph finale 7,5.
Preparazione: secondo le istruzioni presenti sulla confezione. Il terreno viene distribuito in provette (5 ml) e sterilizzato.
Tecnica di semina: una o due colonie da disperdere omogeneamente nel terreno un o due gocce di brodocoltura.
Temperatura e tempo di incubazione: 32 – 37°C per 3 – 4 giorni.
Lettura: controllare la crescita del microrganismo osservando la torbidità del terreno ed eseguire poi la prova di Voges Proskauer e quella del rosso metile.
TEST DI VOGES PROSKAUER
Prova di Voges-Proskauer (ricerca dell’acetoina o acetilmetilcarbinolo): la prova mette in evidenza la produzione di acetilmetilcarbinolo derivante dalla fermentazione glicol-butilenica del glucosio. Il ph del terreno in questo caso si avvicina alla neutralità. L’acetilmetilcarbinolo o acetoina può ossidarsi ad opera di una deidrogenasi NAD dipendente, ma può ossidarsi anche spontaneamente a diacetile. E’ proprio il diacetile che dà la reazione di Voges Proskauer.
Terreno utilizzato: Brodo RMVP. Eseguire la prova dopo 2 giorni di incubazione.
Reattivo utilizzato: Soluzione KOH 40%, Soluzione 1-naftolo (o alfa naftolo).
Procedimento: Prelevare 1 ml di brodocoltura. Aggiungere 0,2 ml di soluzione KOH 40% e 0,6 ml di sol. 1-naftolo.
Tempo di reazione: 10 minuti, agitando di tanto in tanto, lasciare esposto all’aria.
Prova positiva: Colorazione rossa
Prova negativa: Nessuna colorazione
Norme di sicurezza - Precauzione / prevenzione:
- Prelevare la brodocoltura con pipetta monouso, o puntale monouso o pipetta vetro con pipettatore;
- Eliminare i materiali monouso e la coltura dopo lettura previa sterilizzazione. Pipette vetro decontaminare con ipoclorito.
Rischio possibile: Produzione di aerosols e Contaminazione.
TEST DEL ROSSO METILE (MR)
Mette in evidenza l’elevata acidità del terreno di coltura (ph < 4,5) dovuta all’accumulo di prodotti della fermentazione acido-mista del glucosio.
Terreno utilizzato: Eseguire la prova dopo almeno 3 giorni di incubazione
Reattivo utilizzato: Soluzione di rosso metile
Procedimento: Alla brodocoltura rimasta dopo l’esecuzione della prova VP aggiungere 4-5 gocce di soluzione di rosso metile.
Tempo di reazione: Immediata
Prova positiva: Colorazione rossa
Prova negativa:Colorazione gialla o arancione
Norme di sicurezza - Precauzione / prevenzione: Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione.
Rischio possibile: Contaminazione con colture batteriche.