Glicolisi

GLICOLISI: SPIEGAZIONE

La glicolisi è una via del catabolismo glucidico, attiva in tutte le cellule. È un’ossido-riduzione in cui per ogni molecola di glucosio che si ossida, 2 NAD+ si riducono a 2NADH, producendo due molecole di piruvato. Le ossidazioni sono favorite in quanto si rompono legami, aumentando il numero delle specie chimiche, e aumenta il disordine del sistema; inoltre i legami che si formano sono più forti perché il gruppo carbossilico del piruvato è stabilizzato per risonanza. Essendo una via catabolica, si sintetizzano 2ATP a partire da 2ADP e 2Pi.

GLICOLISI: REAZIONE

La glicolisi comprende dieci reazioni:

1. Esochinasi. Il gruppo fosforico dall’ATP viene trasferito sul C in posizione 6 del glucosio per dare glucosio-6-fosfato. L’esochinasi è una transferasi non specifica; tuttavia, nel fegato esiste l’isoforma 4 che è specifica per il glucosio e viene detta glucochinasi. L’energia del legame fosfoanidridico che si rompe è alta e il delta G della reazione è molto negativo, per cui la reazione è irreversibile.
   L’ossigeno presente su C6 cede una coppia di elettroni all’ultimo fosfato di ATP, per cui si forma un intermedio e la reazione si conclude con la rottura del legame fosfoanidridico. La reazione è facilitata dal fatto che l’enzima elimina l’acqua dal sito attivo, evitando così che sia l’ossigeno di una molecola di acqua a donare gli elettroni al fosfato, perché in questo caso avverrebbe l’idrolisi di ATP senza alcun prodotto. Con l’attacco del fosfato sul glucosio si introducono cariche negative su di esso, impedendo al glucosio di uscire dalla cellula. Questa reazione è un’eccezione, in quanto consuma ATP pur essendo catabolica.
2. Fosfoglucoisomerasi. Reazione di isomerizzazione in cui il glucosio-6-fosfato viene convertito in fruttosio-6-fosfato, convertendo il gruppo aldeidico in posizione 1 con un gruppo chetonico in posizione 2 (è necessario per posizionare il doppio legame C=O in posizione ottimale per la stabilizzazione del carbanione nella 4° reazione). Poiché i legami che si rompono e quelli che si formano sono simili, la reazione è reversibile.
   - Conversione della forma ciclica in forma aperta rompendo il legame emiacetalico.
   - Isomerizzazione con meccanismo di catalisi acido-base.
   - Formazione del legame emiacetalico per ripristinare la struttura ciclica.
3. Fosfofruttochinasi. Si lega un gruppo fosforilico in posizione 1 al fruttosio-6-fosfato producendo fruttosio-1,6-bifosfato. Poiché si rompe un legame fosfoanidridico dell’ATP la reazione è irreversibile. L’enzima esclude l’acqua dal sito attivo; l’ossigeno del gruppo –OH in posizione 1 cede elettroni al gruppo fosforilico. Come nella prima reazione è necessario il magnesio, in quanto i nucleotidi polifosfati sono complessati sempre a cationi.
4. Aldolasi. Si rompe il legame tra C3 e C4 nella molecola di fruttosio-1,6-bifosfato e si ottengono due zuccheri a 3C, un aldoso e un chetoso: diidrossiacetone fosfato e gliceraldeide-3-fosfato. Il gruppo –OH del C4 si scinde e diventa un gruppo chetonico, ma in questo modo si forma un carbanione, stabilizzato per risonanza grazie alla presenza del gruppo C=O adiacente al C con carica negativa, sul quale vengono delocalizzati gli elettroni. Convertire il glucosio in fruttosio nella seconda reazione è quindi funzionale a posizione il gruppo C=O nella posizione giusta per stabilizzare il carbanione. L’enzima interviene ulteriormente nella stabilizzazione del carbanione in vario modo:
   - l’aldolasi più comune è quella di tipo 2 e utilizza un meccanismo elettrostatico. È una proteina coniugata con uno ione zinco in vicinanza dell’ossigeno del C=O, per cui contribuisce alla delocalizzazione elettronica perché la carica positiva dello zinco attira gli elettroni e facilita la formazione del carbanione;
   - l’aldolasi di tipo 1 utilizza un meccanismo di catalisi covalente, perché ha nel sito attivo un residuo di lisina, che si trova in prossimità del gruppo chetonico del fruttosio. Quando l’aldolasi lega il substrato si forma un legame covalente con esso: l’N della lisina forma un doppio legame con il C di esso, sostituendo l’O e si forma una base di Schiff, che favorisce ulteriormente la stabilizzazione per risonanza perché i due elettroni vengono trasferiti sull’azoto della lisina e il carbanione è neutralizzato. La reazione termina quando il carbanione stabilizzato lega un H+ e si forma il diidrossiacetone fosfato.
   La reazione è favorita da un punto di viste entropico dalla rottura dei legami, ma si formano legami più deboli quindi è sfavorita dal punto di vista entalpico ed è sfavorita anche dalla repulsione elettrostatica, per cui il suo delta G sarebbe positivo. Tuttavia viene resa possibile dal fatto che la concentrazione del substrato è molto maggiore rispetto a quella dei prodotti, in quanto il substrato è prodotto con reazioni irreversibili (grandi quantità di fruttosio-1,6-bifosfato), quindi se le concentrazioni sono unitarie non avviene.
5. Trioso fosfato isomerasi. Interconversione di gliceraldeide-3-fosfato e diidrossiacetone fosfato, utilizzando il meccanismo di catalisi acido-base.
6. Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). Si ossida il gruppo aldeidico della gliceraldeide-3-fosfato e si ottiene acido-1,3-fosfoglicerico; contemporaneamente NAD+ si riduce a NADH. Inoltre, si utilizza il delta G con il meccanismo delle reazioni accoppiate: il fosfato inorganico è un substrato inglobato nel prodotto, così da produrre un composto con un legame dall’energia simile a quella del legame fosfoanidridico dell’ATP. Per non disperdere delta G sotto forma di calore la reazione non procede con l’idratazione dell’aldeide. Piuttosto, nel sito attivo dell’enzima c’è un residuo di cisteina con un gruppo –SH sulla catena laterale, vicino al quale è presente un aminoacido basico. Lo zolfo della cisteina cede elettroni al gruppo carbonilico, così si forma un tioemiacetale, in cui è presente un legame covalente tra l’enzima e il substrato, che ha addizionato un gruppo sulfidrilico. La reazione prosegue con il NAD+ che strappando un idrogeno (NADH) consente la formazione di un doppio legame C=O, producendo un tioestere. I tioesteri sono composti ad alta energia perché è molto facile convertirli in anidridi fosforiche con l’aggiunta di un fosfato al C: il C lega il fosfato e cede elettroni allo zolfo, che lega un protone ceduto dall’aminoacido basico. In questo modo l’enzima si ripresenta nella forma iniziale e si libera 1,3-bifosfoglicerato.
7. Fosfoglicerato chinasi. Si trasferisce un gruppo fosforilico sull’ADP producendo ATP e 3-fosfoglicerato.
8. Fosfoglicerato mutasi. Isomerizzazione che produce 2-fosfoglicerato dal 3-fosfoglicerato, sfruttando un’istidina fosforilata presente nel sito attivo dell’enzima e producendo un intermedio fosfoglicerato, il 2,3-bifosfoglicerato.
9. Enolasi. Si elimina una molecola di acqua eliminando il gruppo –OH in posizione 3 e l’atomo di idrogeno in posizione 2, introducendo un doppio legame tra C2 e C3 e liberando fosfoenolpiruvato.
10. Piruvato chinasi. Si sintetizza ATP trasferendo il gruppo fosforilico del substrato su ADP. Si rompe un legame fosfoesterico per formarne uno fosfoanidridico e questo è possibile perché contestualmente si converte la forma enolica del piruvato in forma chetonica.
    - Trasferimento del gruppo fosforilico e produzione di ATP ed enolato.
    - Il carbonio cede elettroni del doppio legame per legare un H+ e formare piruvato.
    La sintesi d ATP con il fosfoestere non avviene per motivi termodinamici, per cui nelle reazioni precedenti si trasforma il fosfoestere in un enolo fosfato, così la sintesi può avvenire non solo trasferendo il gruppo fosforilico, ma anche sfruttando l’isomerizzazione.

Esiste una variante della glicolisi nei globuli rossi: il 2,3-bifosfoglicerato negli eritrociti funziona da effettore allosterico dell’emoglobina, riducendo l’affinità di questa per l’ossigeno e quindi consentendo un maggior rilascio di ossigeno nei tessuti con pO2 bassa.

Per questo la glicolisi negli eritrociti è stata modificata in modo tale da produrre 2,3-bifosfoglicerato come molecola libera e non come intermedio nel sito attivo dell’enzima; questo è possibile affiancando alla fosfoglicerato chinasi due enzimi:

• 1,3-bifosfoglicerato mutasi trasferisce il gruppo fosforilico dalla posizione 1 alla 2;
• 2,3-bifosfoglicerato fosfatasi stacca il gruppo fosforilico in posizione 2 e produce 3-fosfoglicerato e 2-fosfoglicerato.

In questo modo si perde un ATP per ogni molecola di 1,3-bifosfoglicerato, quindi non si produce ATP in questa glicolisi, ma si producono grandi quantità di 2,3-bifosfoglicerato usato come modulatore allosterico.

METABOLISMO DI MONOSACCARIDI DIVERSI DAL GLUCOSIO

Attraverso specifici enzimi possono essere convertiti in intermedi della glicolisi.

• Via dei pentosi.
• Esosi.

L’esochinasi non è specifico per il glucosio, quindi può utilizzare anche altri esosi, come il mannosio o il fruttosio producendo le corrispondenti forme con il gruppo fosforico in posizione 6:

• il fruttosio-6-P è già un intermedio;
• il mannosio-6-P viene convertito in fruttosio-6-P dalla fosfomannoisomerasi.

NB: nel fegato esiste una glucochinasi specifica per il glucosio e una fruttochinasi specifica per il fruttosio, che consumando ATP produce fruttosio-1-P. Questo è substrato dell’aldolasi di tipo B, che rompe la molecola con formazione del carbanione da stabilizzare e produce diidrossiacetone-P, intermedio della glicolisi, e gliceraldeide. La gliceraldeide ha due possibili destini:

• gliceraldeide chinasi nel fegato consumando ATP produce gliceraldeide-3-P, inserito nella glicolisi;
• aldo deidrogenasi nel fegato può ridurre la gliceraldeide a glicerolo o viceversa; operando sulla gliceraldeide la converte in glicerolo ossidando NADH a NAD+. Il glicerolo a sua volta può essere fosforilato dalla glicerolo chinasi per dare glicerolo-P, ossidato ulteriormente su C2 dalla glicerolo-fosfato-deidrogenasi producendo diidrossiacetone-P, inserito nella glicolisi.

Perché si utilizzano vie complesse per inserire il fruttosio nella glicolisi? Il glicerolo e il glicerolo-P sono substrati di altre vie metaboliche, come la sintesi di trigliceridi o fosfogliceridi, quindi attraverso la via complessa il fegato può scegliere se inserire il fruttosio nella glicolisi o usarlo per produrre molecole. Inoltre, in questo modo glicerolo e glicerolo-P sono prodotti dal fruttosio minimizzando il dispendio energetico, perché se si ottenessero dal glucosio si consumerebbe 1ATP in più. Se manca aldolasi di tipo B si ha intolleranza al fruttosio, perché si accumula fruttosio-1-P che è tossico e inibisce gli altri enzimi.

DESTINO METABOLICO DEL PIRUVATO

Più frequentemente il piruvato viene convertito in acetil-CoA per completare la seconda fase del catabolismo nei mitocondri; però non tutte le cellule hanno mitocondri, quindi può avere destino diverso.

• In assenza di mitocondri la L-lattato deidrogenasi riduce il gruppo chetonico del piruvato a gruppo alcolico e NADH, presente in quanto prodotto della glicolisi, si ossida a NAD+. Se la glicolisi è seguita dalla reazione della lattato deidrogenasi l’insieme dei processi è detto fermentazione lattica o glicolisi anaerobia. Questa reazione avviene nei globuli rossi, che sono privi di mitocondri, ma anche nel muscolo bianco, che ne ha pochi e quando si contrae rapidamente produce più piruvato di quello smaltibile dai mitocondri e l’eccesso va incontro a fermentazione lattica. La fermentazione lattica nei muscoli con pochi mitocondri è svantaggiata per minor resa rispetto alla fosforilazione ossidativa, in quanto si producono 2ATP, tuttavia il vantaggio è la velocità in quanto sono reazioni citosoliche: si produce meno ATP, ma più velocemente, poiché il muscolo bianco serve per sforzi rapidi e brevi.

Se si eliminasse piruvato dalla cellula senza trasformarlo in lattato si accumulerebbe NADH, che è un prodotto della reazione della gliceraldeide-3-P deidrogenasi.

Essendo questa reversibile arriverebbe a bloccarsi e quindi si accumulerebbero i suoi substrati, aumentando a sua volta il delta G della reazione dell’aldolasi e poi anche quello della fosfofruttochinasi e così via, quindi se aumenta la concentrazione di NADH si bloccano tutte le reazioni a monte. La conversione del piruvato non è essenziale alla formazione del lattato, ma per lo smaltimento del NADH.

• In presenza di mitocondri avviene il metabolismo aerobio, che inizia con la conversione di piruvato in acetil-CoA. Si scinde il legame tra C2 e C3 del piruvato, formando anidride carbonica e un gruppo acetilico che viene esterificato con CoA a dare acetil-CoA, un tioestere che serve per conservare energia. Contemporaneamente all’ossidazione del C, il NAD+ si riduce a NADH. È una reazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi, che ha come coenzima la tiamina pirofosfato, che interviene nella stabilizzazione del carbanione che si ottiene dalla scissione del legame C-C. In particolare, in questo caso la formazione del carbanione è ostacolata perché si deve formare su un C sfavorito, perché è tendenzialmente positivo e posto accanto a un ossigeno elettronegativo.

La tiamina pirofosfato, o vitamina B1, è un’amina con un anello tiazolico unito da un ponte metilenico a un anello pirimidinico e due gruppi fosforilici. L’anello tiazolico ha due proprietà fondamentali che servono a stabilizzare il carbanione:

• orbitali delocalizzati con livelli energetici vicini, per cui può cedere e acquistare elettroni facilmente;
• la delocalizzazione dell’anello rende debole il legame tra C2 e H, che può facilmente dissociarsi lasciando una carica negativa su C; normalmente il C non è acido, ma qui è interposto tra un N carico positivamente e un S con parziale carica positiva, quindi il legame C-H è fortemente polarizzato.

La piruvato deidrogenasi lega il piruvato: il C dell’anello tiazolico ha perso una carica positiva, quindi ha formato un carbanione e cede elettroni al C2 del piruvato, che lega un protone ceduto da un residuo aminoacidico dell’enzima formando un intermedio tetraedrico. Dopo aver legato la tiamina avviene la decarbossilazione: i due elettroni del legame tra C2 e C3 passano su C2, dove si forma il carbanione, liberando CO2. Il carbanione si forma perché è stabilizzato per risonanza grazie alla delocalizzazione dell’anello tiazolico, estesa a tutta la tiamina.

Il carbanione è un reagente nucleofilo e può legare il più semplice elettrofilo, H+. Se lega un protone si forma un composto idrossietilico legato all’anello tiazolico. Questo intermedio tetraedrico si risolve con la formazione di un doppio legame C=O. L’effetto finale è la rottura del legame covalente con la tiamina e la liberazione di acetaldeide.

NB: nei lieviti è presente la piruvato decarbossilasi che dal piruvato produce acetaldeide e CO2; poi, essendo presente l’aldo deidrogenasi, l’acetaldeide è ridotta usando il NADH della glicolisi per produrre etanolo. Queste due reazioni accoppiate alla glicolisi danno fermentazione alcolica: il glucosio viene convertito in due molecole di etanolo, 2CO2 e 2ATP, riciclando il NADH; anche in questo caso la necessità è il consumo di NADH per portare avanti il processo.

Lo svantaggio di questo processo è la dispersione di delta G sotto forma di calore; questo può essere evitato se il carbanione interagisce con un elettrofilo diverso da H+, per es. l’acido lipoico. Questo coenzima della piruvato deidrogenasi è un acido carbossilico a 8C con un ponte disolforico tra C6 e C8 che si comporta da elettrofilo: si scinde il legame S-S e due elettroni dallo zolfo in posizione 6 vengono spostati sullo zolfo in posizione 8, che li sfrutta per legare il gruppo idrossietilico del carbanione. In questo modo si forma un intermedio tetraedrico, l’idrossietil lipoamide. L’intermedio si risolve con la formazione di un doppio legame C=O: si scinde il legame con la tiamina e si forma un gruppo acetilico legato all’acido lipoico, l’acetillipoato, o acetil-lipoamide o acetil-lipoA. In questo modo si utilizza l’energia del processo ossidativo per formare un legame tioesterico ad alta energia, piuttosto che dissiparla come calore e disordine.

Avviene infine una transfesterificazione che lega il gruppo acetilico dell’acetil-lipoA allo zolfo del coenzima A, producendo acetil-CoA (che contiene parte dell’energia della decarbossilazione ossidativa). A livello dell’acido lipoico lo zolfo rimane con una carica negativa e lega un protone, formando l’acido diidrolipoico, un derivato con due gruppi SH al posto del ponte disolforico. Per ripristinare l’acido lipoico si utilizza il FAD, che lega gli atomi di H e riforma il ponte disolforico; poi il FAD cede due elettroni e uno ione idruro al NAD+, che si riduce a NADH, mentre l’altro protone rimane libero.

La reazione della piruvato deidrogenasi è catalizzata da un complesso formato da tre enzimi associati tra loro e le varie tappe avvengono in siti attivi diversi, sfruttando tre diversi coenzimi:

1. piruvato decarbossilasi o deidrogenasi catalizza la decarbossilazione usando la tiamina;
2. diidrolipoil-transacetilasi usa acido lipoico;
3. diidrolipoil deidrogenasi usa FAD.

Questi tre enzimi lavorano insieme grazie alla funzione di accoppiamento alla lipoamide: l’acido lipoico è unito alla lisina e in questo modo forma un asse molecolare, la lipoamide, che oscilla durante il ciclo catalitico e sposta i vari componenti della reazione da un sito attivo all’altro. 

Domande & Risposte
• Quante molecole di ATP si formano nella glicolisi?

  2 molecole di ATP.

• Qual è il prodotto finale della glicolisi?

  Il piruvato.

• Quali sono le reazioni irreversibili della glicolisi?

  Esochinasi, fosfofruttochinasi e piruvato chinasi.

• Quali sono le differenze principali tra la fase endoergonica e la fase Esoergonica della glicolisi?

  Nella fase endoergonica sono utilizzate 2 molecole di ATP mentre nella fase esoergonica si ha una produzione di 4 molecole di ATP e di 2 di NADH per ogni molecola di glucosio.

• Dove avviene la glicolisi?

  Nel citosol.