Studio del Metabolismo Batterico

La prova ha lo scopo di evidenziare la modalità con cui un microrganismo può demolire (metabolizzare) uno zucchero.
Il test è di solito utilizzato per verificare il tipo di metabolismo nei confronti del glucosio
(altri zuccheri utilizzati sono lattosio e maltosio)
il terreno contiene una bassa quantità di peptoni per evitare che una loro degradazione, con metabolismo ossidativi, porti alla formazione di prodotti  alcalini che maschererebbero l’acidità derivante dal carboidrato.
L’agar –agar presente nel terreno impedisce ai prodotti acidi formatisi di disperdersi verso la superficie con conseguente loro diluizione. Ciò renderebbe difficile  l’interpretazione del test.

Procedimento:
la prova si esegue a partire da colonie batteriche e non da colture liquide.
Il terreno utilizzato per la prova deve essere sterile.

Terreno: Hugh – Leifson medium  (test O/F medium)
Composizione                                 g/l
Digerito pancreatico di caseina         2
Sodio cloruro                                  5
K2HPO4                                        0,3
Agar-agar                                        2,5
Blu di bromotimolo                          0,03

pH finale  7,1+0,1                                                   

Preparazione del terreno:
il terreno base viene preparato secondo le indicazioni riportate sulla confezione.
Lo zucchero da saggiare può essere addizionato al terreno:

• Durante la preparazione, pesando la quantità necessaria e sciogliendola nel terreno

In questo caso è necessario utilizzare una temperatura di sterilizzazione di 115-118°C
Per 10 –15 min.

• Dopo la sterilizzazione del terreno addizionando una soluzione dello zucchero sterilizzato per filtrazione, la concentrazione finale dello zucchero nel terreno pronto per l’uso deve essere dell1%. Ciò si realizza preparando e sterilizzando una soluzione al 10% del carboidrato e addizionandone 10 ml per ogni 100 ml di base.
  
  

Inoculo del terreno:
devono essere inoculate, per ogni test , 2 provette di terreno.
Prelevare con un ago una porzione di colonia o una colonia intera.
Eseguire una infissione per 2/3 del terreno, il terreno è semisolido e tale tipo di semina va quindi fatta con attenzione: sterilizzando tutto l’ago che viene infisso nel terreno,
raffreddandolo bene per non liquefare il terreno durante l’inoculo.
In una dei due terreni inoculati stratificare alcuni ml di olio minerale (olio di vaselina o paraffina) in modo da ottenere uno strato di 2-3 cm sopra la superficie del terreno.

Temperatura e tempo di incubazione:
37°C o la temperatura ottimale del microrganismo in esame
fino a 7 giorni dopo l’inoculo

Lettura: verificare la presenza di sviluppo e l’eventuale viraggio del terreno al giallo o al blu in entrambi i terreni. La lettura viene eseguita ogni 24 ore per 7 giorni

Interpretazione del risultato:

Terreno senza paraffina Aerobiosi	Terreno con paraffina Anaerobiosi	Tipo di metabolismo nei confronti dello zucchero
Giallo	Verde	Met. Ossidativo Microrganismo ossidante     Ox
Giallo	Giallo	Met. Fermentativo Microrganismo fermentante   F
Blu (verde)	Verde (blu)	Microrganismo alcalinizzante Al
Verde	Verde	Nessuna utilizzazione Microrganismo inerte              I

Norme di sicurezza Precauzione / prevenzione	Rischio possibile
Eliminare la coltura ,dopo la lettura, previa sterilizzazione	Contaminazione con colture batteriche