Lo studio del Metabolismo del Glucosio

Esperimenti trattati: Prova di Voges-Proskauer (ricerca dell’acetoina o acetilmetilcarbinolo) - Prova del rosso metile

La prova del rosso metile (RM) e la prova di Voges Proskauer (VP)  sono importanti per l’identificazione degli enterobatteri..
Gli enterobatteri  utilizzano il glucosio  attraverso due particolari vie fermentantative,
che partendo dall’acido piruvico originano prodotti finali diversi:

• la fermentazione butandiolica (o glicol-butilenica)  ha come prodotti finali principali: etanolo, 2,3 butandiolo, acido formico (che  in presenza di formico-idrogenoliasi viene scisso in idrogeno e anidride carbonica)

• la fermentazone acido mista ha come principali prodotti finali:

     etanolo, acido acetico, acido lattico, acido formico (che  in presenza di formico- 
     idrogenoliasi viene scisso in idrogeno e anidride carbonica)

Terreno utilizzato:
brodo MRVP

Composizione g/l
peptone                                    5 g
D(+) glucosio                           5 g
di-potassio idrogeno fosfato     2,5 g
potassio di-idrogeno fosfato     2,5 g   
ph finale                                  7,5

Preparazione:
secondo le istruzioni presenti sulla confezione.
Il terreno viene distribuito in  provette (5 ml)  e sterilizzato.

Tecnica di semina:
una o due colonie da disperdere omogeneamente nel terreno
un o due gocce di brodocoltura 

Temperatura e tempo di incubazione:
32 – 37°C
per 3 – 4 giorni

Lettura:
controllare la crescita del microrganismo osservando la torbidità  del terreno ed eseguire poi la prova di Voges Proskauer e quella del rosso metile.
 

- Prova di Voges-Proskauer (ricerca dell’acetoina o acetilmetilcarbinolo):

la prova mette in evidenza la produzione di acetilmetilcarbinolo derivante dalla fermentazione glicol-butilenica  del glucosio.
Il ph del terreno in questo caso si avvicina alla neutralità.
L’acetilmetilcarbinolo o acetoina  può ossidarsi ad opera di una deidrogenasi NAD dipendente, ma può ossidarsi anche spontaneamente a diacetile. E’ proprio il diacetile che dà la reazione di Voges Proskauer.

Prova di Voges Proskauer (VP)
Terreno utilizzato	Reattivo utilizzato	Procedimento
Brodo RMVP Eseguire la prova dopo 2 giorni di incubazione	Soluzione KOH 40% Soluzione 1-naftolo (o alfa naftolo)	Prelevare 1 ml di brodocoltura Aggiungere 0,2 ml di soluzione KOH 40% e 0,6 ml di sol. 1-naftolo

Prova di Voges Proskauer (VP)
Tempo di reazione	Prova positiva	Prova negativa
10 minuti, agitando di tanto in tanto, lasciare esposto all’aria.	Colorazione rossa	Nessuna colorazione

Norme di sicurezza Precauzione / prevenzione	Rischio possibile
Prelevare la brodocoltura con pipetta monouso, o puntale monouso o pipetta vetro con pipettatore	Produzione di aerosols Contaminazione
Eliminare i materiali monouso e la coltura dopo lettura previa sterilizzazione Pipette vetro decontaminare con ipoclorito	Contaminazione

- Prova del rosso metile:
mette in evidenza l’elevata acidità del terreno di coltura (ph < 4,5)  dovuta all’accumulo di  prodotti della fermentazione acido-mista del glucosio.

Prova del rosso metile (RM)
Terreno utilizzato	Reattivo utilizzato	Procedimento
Eseguire la prova dopo almeno 3 giorni di incubazione	Soluzione di rosso metile	Alla brodocoltura rimasta dopo l’esecuzione della prova VP aggiungere 4-5  gocce di soluzione di rosso metile

Prova del rosso metile (RM)
Tempo di reazione	Prova positiva	Prova negativa
Immediata	Colorazione rossa	Colorazione gialla o arancione

Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione
Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione

Rischio possibile
Contaminazione con colture batteriche