La degradazione degli amminoacidi

La prova permette di evidenziare l’utilizzazione di un amminoacido da parte di un microrganismo. L ‘avvenuta utilizzazione può essere messa in evidenza:

1. evidenziando la scomparsa dell’amminoacido (procedura piuttosto complessa)
2. evidenziando la formazione di prodotti del metabolismo dell’amminoacido (es: ammine e  anidride carbonica)

I metodi utilizzati in laboratorio sfruttano, al fine di evidenziare l’utilizzazione dell’amminoacido, l’accumulo di ammine e il conseguente innalzamento del pH del terreno che viene messo in evidenza dal viraggio di un indicatore.
I metodi di laboratorio più comuni consentono di evidenziare l’utilizzazione solo di tre amminoacidi:

1. arginina
2. lisina
3. ornitina

Per gli altri amminoacidi le procedure risultano molto complesse e difficilmente utilizzabili nella routine. I terreni utilizzati per l’esecuzione della prova possono variare nella composizione a seconda della specie batterica in esame.

Terreno utilizzato:
brodo per decarbossilazione di Moeller

Composizione in g/l

Peptone                               5        g
Estratto di carne                   5        g
Glucosio                              0,5     g
Piridossale                           0,005 g
Bromocresolo porpora        0,02   g

pH finale 6,0 + 0,1

Preparazione:
Seguire le istruzioni presenti sulla confezione del terreno. Al terreno base va addizionato l’amminoacido da saggiare in concentrazione pari all’1% (p/v)  se si dispone dell’amminoacido in forma L : L-arginina, L-lisina, L-ornitina.
Se si dispone di amminoacidi in forma DL la concentrazione nel terreno deve essere del 2% (p/v). Il terreno viene distribuito in provetta (4-5 ml).

NOTA BENE:

1. Controllare con cura il pH del terreno prima della distribuzione.
2. Preparare sempre una provetta di terreno base senza amminoacidi come controllo.
3. Il terreno pronto per l’uso ha una colorazione porpora.
   
   

Tecnica di semina:
per dispersione con ansa, evitando inoculi pesanti (troppo abbondanti)
Inoculare anche un terreno senza amminoacido come controllo negativo.
Dopo l’inoculo versare sulla superficie del terreno uno strato di olio di vaselina (o paraffina liquida).
Tale  operazione va eseguita facendo scorrere lentamente lungo le pareti della provetta la paraffina in modo da stratificarla sulla superficie liquida.

Temperatura e tempo di incubazione:
37°C per 4 giorni.

Lettura:
controllare giornalmente le variazioni di colore del terreno con amminoacido e del terreno di controllo (senza amminoacido).

Periodo di incubazione	Terreno con amminoacido	Terreno di controllo (senza amminoacido)	Esito della prova
Dopo 24 ore	Giallo	Giallo	Non ancora determinato
Dopo 4 giorni	Giallo	Giallo	Negativo amminoacido non utilizzato
Dopo 4 giorni	Porpora	Giallo	Positivo amminoacido utilizzato

La fermentazione del glucosio e il conseguente abbassamento del pH del terreno favorisce le reazioni di decarbossilazione.
Tali reazioni producono ammine che rendono alcalino il terreno con conseguente viraggio dell’indicatore da giallo a porpora.

Norme di sicurezza
Precauzione / prevenzione
Eliminare la coltura dopo lettura previa sterilizzazione

Rischio possibile
Contaminazione con colture batteriche